革蘭染色（1884年創(chuàng)立的細(xì)菌鑒別方法）
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革蘭染色
1884年創(chuàng)立的細(xì)菌鑒別方法
革蘭染色法，由丹麥病理學(xué)家Christain Gram于1884年創(chuàng)立，是細(xì)菌學(xué)中很重要的鑒別染色法，因?yàn)橥ㄟ^(guò)此法染色，可將細(xì)菌鑒別為革蘭陽(yáng)性菌（G+）和革蘭陰性菌（G-）兩大類。
基本信息
| 中文名 | 革蘭染色 |
| 創(chuàng)立者 | Christain Gram |
| 操作流程 | 初染、媒染、脫色、復(fù)染 |
| 注意事項(xiàng) | 陰性菌透性大，易脫色 |
| 用途 | 細(xì)菌 鑒別 |
| 創(chuàng)立時(shí)間 | 1884年 |
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簡(jiǎn)介
細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶染色，而經(jīng)碘液媒染后，用酒精脫色，在一定條件下有的細(xì)菌此色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細(xì)菌分為兩大類，前者叫做革蘭氏陽(yáng)性菌（G+），后者為革蘭氏陰性菌（G—）。為觀察方便，脫色后再用一種紅色染料如堿性蕃紅、稀釋復(fù)紅等進(jìn)行復(fù)染。陽(yáng)性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。有芽胞的桿菌和絕大多數(shù)的球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏正反應(yīng)；弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病性的無(wú)芽胞桿菌都呈現(xiàn)負(fù)反應(yīng)。革蘭氏陽(yáng)性菌對(duì)青霉素敏感，革蘭氏陰性菌對(duì)鏈霉素敏感。可根據(jù)革蘭氏染色法鑒別不同菌種并對(duì)癥下藥。
革蘭染色
革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌在化學(xué)組成和生理性質(zhì)上有很多差別，染色反應(yīng)不一樣。現(xiàn)在一般認(rèn)為革蘭氏陽(yáng)性菌體內(nèi)含有特殊的核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復(fù)合物，它與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合很牢，不易脫色，陰性菌復(fù)合物結(jié)合程度底，吸附染料差，易脫色，這是染色反應(yīng)的主要依據(jù)。另外，陽(yáng)性菌菌體等電點(diǎn)較陰性菌為低，在相同PH條件下進(jìn)行染色，陽(yáng)性菌吸附堿性染料很多，因此不易脫去，陰性菌則相反。所以染色時(shí)的條件要嚴(yán)格控制。例如，在強(qiáng)堿的條件下進(jìn)行染色，兩類菌吸附堿性染料都多，都可呈正反應(yīng)；PH很低時(shí)，則可都呈負(fù)反應(yīng)。此外，兩類菌的細(xì)胞壁等對(duì)結(jié)晶紫—碘復(fù)合物的通透性也不一致，陽(yáng)性菌透性小，故不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色。所以脫色時(shí)間，脫色方法也應(yīng)嚴(yán)格控制。
染色原理
染液組分
堿性染料
這在簡(jiǎn)單染色中已討論過(guò)，此處用結(jié)晶紫。
媒染劑
其作用是增強(qiáng)染料與細(xì)菌的親和力，更好地加強(qiáng)染料與細(xì)胞的結(jié)合。常用的媒染劑是碘液。
脫色劑
幫助染料從被染色的細(xì)胞中脫色。利用細(xì)菌對(duì)染料脫色的難易程度不同，而將細(xì)菌加以區(qū)分。革蘭陽(yáng)性細(xì)菌不易被脫色劑脫色，而革蘭陰性細(xì)菌則易被脫色。常用的脫色劑是丙酮或乙醇，這里所用的是95%的乙醇。
復(fù)染液
實(shí)驗(yàn)步驟
革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個(gè)步驟，具體操作方法是：
（3）自來(lái)水沖洗，去掉浮色。
（5）用中性脫色劑如乙醇（95%）或丙酮酸脫色30秒，革蘭氏陽(yáng)性菌不被褪色而呈紫色，革蘭氏陰性菌被褪色而呈無(wú)色。
（6）用蕃紅染液復(fù)染30秒，革蘭氏陽(yáng)性菌仍呈紫色，革蘭氏陰性菌則呈現(xiàn)紅色。革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌即被區(qū)別開(kāi)。
固定目的
② 保證菌體能牢固地粘附在載玻片上，以免水洗時(shí)被水沖掉；
實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象
實(shí)驗(yàn)原理
革蘭染色
①革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞壁
G+細(xì)菌細(xì)胞壁具有較厚（20-80nm）而致密的肽聚糖層，多達(dá)20層，占細(xì)胞壁成分的60%～90%，它同細(xì)胞膜的外層緊密相連（圖2-9）。有的G+細(xì)菌細(xì)胞壁中含有磷壁酸（teichoic-acid），也稱胞壁質(zhì)（murein），它是甘油和核糖醇的聚合物，磷壁酸通常以糖或氨基酸的酯而存在。由于磷壁酸帶負(fù)電荷，它在細(xì)胞表面能調(diào)節(jié)陽(yáng)離子濃度。磷壁酸與細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)，細(xì)胞生長(zhǎng)中有自溶素（autolysins）酶類起作用，磷壁酸對(duì)自溶素有調(diào)節(jié)功能，阻止胞壁過(guò)度降解和壁溶。
如果細(xì)胞壁的肽聚糖層被消溶，G+細(xì)胞成為原生質(zhì)體（protoplasts），細(xì)胞壁不復(fù)存在，而只存留細(xì)胞膜。除鏈球菌外，大多數(shù)G+細(xì)菌細(xì)胞壁中含極少蛋白質(zhì)。
②革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁 Gˉ細(xì)菌細(xì)胞壁比G+細(xì)菌細(xì)胞壁薄（15～20nm）而結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，分外膜（outer membrane）和肽聚糖層（2～3nm）。在細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜之間有一個(gè)明顯的空間，稱為壁膜間隙（periplasmic space）。
外膜 Gˉ細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的基本成分是脂多糖（lipopolysaccharide,LPS），它同細(xì)胞質(zhì)膜相同之處也是雙層類脂，但除磷脂外還含有多糖和蛋白質(zhì)。
LPS的多糖部分包括核心多糖和O-特異多糖。O-特異多糖由重復(fù)分支的碳水化合物分子組成，含有已糖（葡萄糖、半乳糖和鼠李糖）和二脫氧已糖。由于糖的種類不同，使各種Gˉ細(xì)胞具有不同特性的LPS。核心多糖（core polysaccharide）的主要組分是酮脫氧辛酸（ketodeoxyoctonate, KDO）。
外膜中還含有幾種蛋白，如脂蛋白、通透蛋白。有些蛋白具有通孔作用（porin），調(diào)控外界分子進(jìn)入細(xì)胞；有的蛋白分子可以作為噬菌體的受體；許多G-細(xì)菌對(duì)高等生物有致病性是由LPS的成分決定的，它的毒性組分常稱為內(nèi)毒素（endotoxins）。
肽聚糖層 Gˉ細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖層很薄，在大腸桿菌和其它細(xì)菌中僅有單
層。肽聚糖層和外膜的內(nèi)層之間通過(guò)脂蛋白連接起來(lái)。
壁膜間隙 Gˉ細(xì)菌細(xì)胞壁的外膜與細(xì)胞質(zhì)膜之間存在明顯的壁膜間隙，一層薄的肽聚糖處于其間，肽聚糖層和細(xì)胞質(zhì)膜之間的間隙較寬，肽聚糖層至外膜之間的間隙較窄。大腸桿菌的壁膜間隙寬度為12～15nm，呈膠胨態(tài)。其間含有三類蛋白質(zhì)：水解酶，催化食物的初步降解；結(jié)合蛋白，啟動(dòng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程；化學(xué)受體（chemoreceptors），在趨化性中起作用的蛋白。
革蘭染色的醫(yī)學(xué)意義：
1、可以協(xié)助鑒定細(xì)菌
3、有助于了解分析細(xì)菌的致病性
影響因素
操作因素
1、涂片太厚 在涂片時(shí)細(xì)菌挑的太多，沒(méi)法分開(kāi)，在脫色時(shí)就不能將第一步染上的結(jié)晶紫的顏色脫去，可能會(huì)使革蘭陰性菌也出現(xiàn)紫色，誤認(rèn)為革蘭陽(yáng)性菌。
2、脫色時(shí)間 陽(yáng)性菌透性小，不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色；但這是在固定的時(shí)間條件下的結(jié)果，如果延長(zhǎng)脫色時(shí)間，也會(huì)使脫色劑滲透進(jìn)陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁中，使染上的結(jié)晶紫脫去顏色，最后染上復(fù)紅的顏色，變成革蘭陰性菌。而脫色時(shí)間太短的話又會(huì)使陰性菌染上的結(jié)晶紫不能完全脫色，出現(xiàn)紫色，誤認(rèn)為革蘭陽(yáng)性菌。
3、固定方法 固定不僅能殺死細(xì)菌，改變細(xì)菌對(duì)染料的通透性，還能使細(xì)菌吸附在玻片上，保持原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)。固定方法是將干燥后的細(xì)菌涂片以中等速度通過(guò)火焰三次，以玻片觸及手背皮膚熱而不燙為宜。但在實(shí)際操作中有的同學(xué)將玻片在火焰上烤的太久，改變了細(xì)菌原有的通透性，會(huì)使細(xì)菌的染色性發(fā)生變化。影響了染色的結(jié)果。
細(xì)菌因素
1、細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間 細(xì)菌的典型形態(tài)、染色性是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取這時(shí)的細(xì)菌做革蘭染色可以反應(yīng)細(xì)菌的真實(shí)的染色性。如果細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間太長(zhǎng)，變成了老齡菌，染色性就會(huì)發(fā)生變化，可能會(huì)使革蘭陽(yáng)性菌染成革蘭陰性菌。
2、培養(yǎng)基的成分 一般認(rèn)為革蘭陽(yáng)性菌體內(nèi)含有特殊的核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復(fù)合物，它與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合很牢，不易脫色。但是如果培養(yǎng)基中缺乏核蛋白質(zhì)鎂鹽就不能合成菌體成分的核蛋白質(zhì)鎂鹽，細(xì)菌與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合就不牢固，容易脫色，可能會(huì)使革蘭陽(yáng)性菌染成革蘭陰性菌。
染液因素
1、碘液 碘液作為媒染劑能增加染料與被染物的親和力。如果碘液放置時(shí)間太長(zhǎng)，或經(jīng)日光照射失效，失去媒染劑的作用，就可能使結(jié)晶紫與細(xì)菌結(jié)合的不牢固，容易被脫色，使革蘭陽(yáng)性菌染成革蘭陰性菌。
2、結(jié)晶紫 結(jié)晶紫的濃度太高，就會(huì)使染上的顏色不容易被酒精脫色，可能會(huì)使革蘭陰性菌染成革蘭陽(yáng)性菌。
3、酒精 酒精作為脫色劑，革蘭染色的脫色酒精濃度為95% ，在此濃度下革蘭陽(yáng)性菌染上的結(jié)晶紫不易被脫去，保留紫色，革蘭陰性菌染上的結(jié)晶紫容易被脫去，最后呈紅色。但當(dāng)酒精的濃度為70% 時(shí)，它的脫色能力最強(qiáng)，可能使革蘭陽(yáng)性菌染上的結(jié)晶紫也被脫去，使革蘭陽(yáng)性菌染成革蘭陰性菌。
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