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瓊脂糖
線性的多聚物
基本信息
| 中文名 | 瓊脂糖 |
| 外文名 | Agarose |
| 別名 | 瓊膠素、瓊膠糖 |
| 化學式 | C24H38O19 |
| 外觀 | 白色或黃色珠狀凝膠顆粒或粉末 |
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概述
瓊脂糖
來源于紅藻的多糖，其主要成分為多聚半乳糖，其中約70%為瓊脂糖，30%為支鏈瓊脂糖。瓊脂糖具線型結構，由D-半乳糖和3,6-脫水半乳糖通過β-1，4和α-1，3連接交替形成重復雙糖單位。支鏈瓊脂糖則從β-1，3鍵分出另一鏈。用熱水從海藻抽提的物質約含40%瓊脂。市售的瓊脂（俗稱洋菜）常呈片狀或疏松繩索狀，通常作食用膠質，藥物包裝劑或細菌培養(yǎng)基使用。純制的瓊脂糖常在生物化學實驗室中，作為電泳、層析等技術中的半固體支持物，用于生物大分子或小分子物質的分離和分析。
瓊脂，它的英文名為agar。這個詞來源于馬來語的agar-agar，意思是膠狀物。又名瓊膠、菜燕、凍粉，是一類從石花菜及其它紅藻類（Rhodophyceae）植物提取出來的藻膠（phycocottoid），在我國及日本已有三百多年（1658年）的歷史。中國人亦稱為洋菜或凍粉。日本人稱之為寒天（kanten），因為它在冬天收獲。臺灣人叫它菜燕，和燕窩的質感差不多。韓國人的叫法是??（不知道啥意思）。
計算化學數(shù)據(jù)
1.疏水參數(shù)計算參考值（XlogP）:無
2.氫鍵供體數(shù)量:0
3.氫鍵受體數(shù)量:1
4.可旋轉化學鍵數(shù)量:6
5.互變異構體數(shù)量:7
6.拓撲分子極性表面積17.1
7.重原子數(shù)量:15
8.表面電荷:0
9.復雜度:178
10.同位素原子數(shù)量:0
11.確定原子立構中心數(shù)量:0
12.不確定原子立構中心數(shù)量:0
13.確定化學鍵立構中心數(shù)量:0
14.不確定化學鍵立構中心數(shù)量:0
15.共價鍵單元數(shù)量:1
物化信息
中文名稱：瓊脂糖
中文別名：瓊脂糖ME
英文名稱:Agarose
英文別名:Agarose, medium EEO, Molecular Biology Grade; agarose, mixture; Agaroseforelectrophoresisofmacromolecules;agarose for molecular biology; agarose 6 B for chromatography; Agarose LE; sepharose(R) 4B for chromatography;
CAS:9012-36-6;62610-50-8
EINECS:232-731-8
分子式:C24H38O19
分子量:630.5471
安全術語:S24/25:Avoid contact with skin and eyes.;
物化性質
熔點:260-481.5℃
相對密度:1.81g/cm3
凝膠性能
瓊脂糖
1937年荒木第一次從瓊脂中分離出瓊脂糖，但直到1961年Hjertin首先發(fā)現(xiàn)了瓊脂糖優(yōu)異的使用性能后才引起了越來越多的關注，并開始工業(yè)生產。瓊脂糖廣泛應用于臨床化驗、生化分析和生物大分子物質的分離等領域。
用途
電泳技術
特點
天然瓊脂（agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（agarose，約占80%）及瓊脂膠（agaropectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構成的中性物質，不帶電荷，而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強酸性多糖，由于這些基團帶有電荷，在電場作用下能產生較強的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質作用而影響電泳速度及分離效果。因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳，其優(yōu)點如下。
（3）瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結果可直接用紫外光燈檢測及定量測定。
（4）電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長期保存。
DNA電泳
瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用主要是依據(jù)它們的相對分子量質量及分子構型，同時與凝膠的濃度也有密切關系。
1．核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關系
（1）DNA分子的大小 在凝膠中，DNA片段遷移距離（遷移率）與堿基對的對數(shù)成反比，因此通過已知大小的標準物移動的距離與未知片段的移動距離時行比較，便可測出未知片段的大小。但是當DNA分子大小超過20kb時，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。此時電泳的遷移率不再依賴于分子大小，因此，就用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時，分子大小不宜超過此值。
（2）瓊脂脂糖的濃度 如下表所示，不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。
表 瓊脂糖濃度與DNA分離范圍
瓊脂糖濃度 /% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
線狀DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1
2．核酸構型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關系
不同構型DNA的移動速度次序為：供價閉環(huán) DNA（covalently closed circular，cccDNA）>直線DNA>開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。當瓊脂糖濃度太高時，環(huán)狀DNA（一般為球形）不能進入膠中，相對遷移率為0（Rm=0），而同等大小的直線雙鏈DNA（剛性棒狀）則可以長軸方向前進（Rm>0），由此可見，這三種構型的相對遷移率主要取決于凝膠濃度，但同時，也受到電流強度、緩沖液離子強度等的影響。
3．電泳方法
（1）凝膠類型
用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型（平板型）。水平型電泳時，凝膠板完全浸泡在電極緩沖液下1-2mm，故又稱為潛水式。目前更多用的是后者，因為它制膠和加樣比較方便，電泳槽簡單，易于制作，又可以根據(jù)需要制備不同規(guī)格的凝膠板，節(jié)約凝膠，因而較受歡迎。
（2）緩沖液系統(tǒng)
缺少離子時，電流太小，DNA遷移慢；相反，高離子強度的緩沖液由于電流太大會大量產熱，嚴重時，會造成膠熔化和DNA的變性。
常用的電泳緩沖液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TAE），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，濃度約為50mmol/L(pH7.5~7.8)。電泳緩沖液一般都配制成濃的貯備液，臨用時稀釋到所需倍數(shù)。
TAE緩沖能力較低，后兩者有足夠高的緩沖能力，因此更常用。TBE濃溶液長期貯存會出現(xiàn)沉淀，為避免此缺點，室溫下貯存5×溶液，用時稀釋10倍0.5×工作溶液即能提供足夠緩沖能力。
（3）凝膠的制備
（4）樣品配制與加樣
DNA 樣品用適量Tris-EDTA緩沖液溶解，緩沖液內含有0.25%溴酚藍或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%~10%甘油，以增加其比重，使樣品集中。為避免蔗糖或甘油可能使電泳結果產生U形條帶，可改用2.5%Ficoll（聚蔗糖）代替蔗糖或甘油。
（5）電泳
瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實驗條件的研究結果表明，在低濃度、低電壓下，分離效果較好。在低電壓條件下，線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。但是，在電場強度增加時，較大的DNA片段遷移率的增加相對較小。因此隨著電壓的增高，電泳分辨率反而下降，為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨率，電場強度不宜高于5V/cm。
電泳系統(tǒng)的溫度對于DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為沒有顯著的影響。通常在室溫下進行電泳，只有當凝膠濃度低于0.5%時，為增加凝膠硬度，可在4℃進行電泳。
（6）染色和拍照
轉移電泳
生物化學與分子生物學的研究工作經常需要對電泳分離后的DNA進行分子雜交，但瓊脂糖不適合于進行雜交操作，1975年，Southren創(chuàng)造了將DNA區(qū)帶原位轉移到硝酸基纖維素膜（NC膜）上，再進行雜交的方法，被稱為Southren印跡法。隨后，Alwine等將類似方法用于RNA印跡，被戲稱為Northern印跡，1979年Towbin等設計了將蛋白質從凝膠轉移到硝酸纖維素膜的裝置，將蛋白質轉移到膜上，再與相應的抗體等配體反應，被戲稱為Western印跡，這種裝置將膜和凝膠、濾紙等制成夾心餅干狀，用低電壓高電流電泳完成轉移。1982年Reinhart等用電轉移法將等電聚焦后的蛋白質區(qū)帶從凝膠轉移到特定膜上，稱Eastern印跡。
目前國內外有多種核酸、蛋白質印跡轉移的電泳裝置出售，使印跡轉移速度快效率高、重復性好，應用更加廣泛。聚丙烯酰胺凝膠也可用于印跡轉移電泳，但轉移蛋白質時，凝膠中不可含有SDS、尿素等變性劑。用于轉移電泳的支持膜亦有多種選擇，近些年用尼龍膜較多，因為尼龍膜機械性能好，烘烤不變脆，使用時比硝酸纖維素膜更方便。
進行印跡轉移電泳時，要注意緩沖液的離子強度要低，pH要遠離pI，使蛋白質帶有較多電荷，一般用穩(wěn)定性較好的Tris-緩沖體系。還要注意凝膠與支持膜之間有能有氣泡。適當提高電壓或電流可以提高轉移速度，但亦會增加熱效應，故電壓或電流不可過高。
凝膠電泳
一般瓊脂糖凝膠電泳只能分離小于20kb的DNA。這是因為在瓊脂糖凝膠中，DNA分子的有效直徑超過凝膠孔徑時，在電場作用下，迫使DNA變形擠過篩孔，而沿著泳動方向伸直，因而分子大小對遷移率影響不大。如此時改變電場方向，則DNA分子必須改變其構象，沿新的泳動方面伸直，而轉向時間與DNA分子大小關系極為密切。1983年Schwartz等人根據(jù)DNA分子彈性弛豫時間（外推為0的滯留時間）與DNA分子大小有關的特性，設計了脈沖電場梯度凝膠，交替采用兩個垂直方向的不均勻電場，使DNA分子在凝膠中不斷改變方向，從而使DNA按分子大小分開。后來Carle等改進了電泳技術，并發(fā)現(xiàn)周期性的反轉換電場(periodic inversion of the electric field)亦能使大分子DNA通過電泳分開。電泳系統(tǒng)是由一水平式電泳槽和兩組獨立、彼此垂直的電極組成，一組電極負極為N，正極為S；另一組負極為W，正極為E。一塊正方形瓊脂糖凝膠板（10cm*10cm或20cm*20cm）呈45度放中央。電場在N-S和W-E之間交替建立。電場交替改變的時間長短與欲分離的DNA分子大小有關。
電泳時，DNA分子處在連續(xù)間隔交替的電場中。首先向S極移動，然后改向E極。在每次電場方向改變時，DNA分子就要有一定的時間松弛，改變形狀和遷移方向。只有當DNA分子達到一定構型后，才能繼續(xù)前時。DNA分子凈移動方向與加樣線垂直，使樣品中各組分沿同一泳道形成各自的區(qū)帶。交變脈沖電泳可有效分離數(shù)百萬堿基對的大分子DNA。較新式的儀器電極間的角度和脈沖時間均可調，使用更加方便。
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作者
